EKSTRAKSI DNA DARI BUAH
A.
TUJUAN PRAKTIKUM
1.
Mahasiswa dapat mendiskusikan tentang DNA
2.
Mahasiswa dpaat membuat reagen yang terkait
dengan percobaan di atas
3.
Mahasiswa dapat memakai alat dalam percobaan ini
4.
Mahasiswa dapat mengumpulkan data dan
menganalisanya
5.
Mahasiswa dapat merumuskan kesimpulan
6.
Mahasiswa dapat mengkomunikasikan hasil
percobaan
B.
DASAR TEORI
Asam nukleat adalaha suatu
polinukleotida yang berfungsi sebagai pembawa, penyimpan dan pentransfer
informasi genetika pada makhluk hidup. Monomer asam nukleat adalah nukleotida.
Komponen penyusun nukleotida adalah basa nitrogen, monosakarida denagn lima
atom C dan gugus fosfat. Asam nukleat ada dua yaitu DNA dan RNA. Untuk
memperoleh DNA dapat dilakukan dengan mengekstraknya dari suatu bahan dengan
menggunakan beberaoa reagen. Komponen DNA adalah basa nitrogen (adenine, timin,
guanine, dan sitosin), Doeksiribosa (monosakarida dengan lima atom C), dan
gugus fosfat. Sedangkan komponen RNA adalah basa nitrogen (Adenin, Urasil,
Guanin, dan Sitosin), ribose,(monosakarida dengan lima atom C) dan gusus fosfat
(TIM BIOKIMIA, 2017)
Ekstraksi DNA adalah langkah
pertama yang sangat penting dalam langkah-langkah kerja analisis DNA
sequencing. Kualitas secara keseluruhan, akurasi dan panjang pembacaan urutan
basa DNA dapat dipengaruhi secara signifikan oleh karakter sampel itu sendiri
dan metode yang dipakai untuk ekstraksi DNA. Mengisolasi DNA dengan kualitas
tinggi dari berbagai jenis sampel memiliki tantangan tertsendiri, dan metode
yang ideal akan beragam bergantung pada jenis jaringan, bagaimana dia diperoleh
dari sumbernya, dan bagaimana sampel ditangani atau disimpan sebelum diesktrak.
Metode untuk isolasi asam nukleat sering dikerjakan menggunakan penghancuran,
mekanik atau metode kimiawi, yang kadang-kadang juga terotomatisasi. Baik metode
ekstraksi manual maupun otomatis yang digunakan kita harus berhati-hatu untuk
meminimalisir degradai DNA dengan menghindari ekspos terhadap panas, cahaya,
Freese-thaw yang berulang-ulang dan vortex. Selanjutnya, laboratorium harus
diatur sedemikian rupa untuk meminimalisir kemungkinan kontaminasi silang
diantara sampel (YUWONO, 2008)
Asam nukleat adalah
makromolekul yang berfungsi sebagau pembawa informasi genetika pada makhluk
hidup. Monomer asam nukleat adalah nukleotida. Komponen penyususn nukleotida adalah
basa nitrogen, monosakarida dengan lima atom C dan gugus fosfat. Untuk
memperoleh DNA dapat dilakukan dengan mengekstraksnya dengan reagen tertentu.
Isolasi DNA juga merupakan
langkah pertama dalam studi sekuen DNA dari pupolasi DNA kompleks dan dalam
analisis struktur gen dan ekspresi gen. Kualitas dan integritas akan mempengaruhi hasil yang
diperoleh secara langsung (SUEZYCKI, 2000)
Dengan meningkatnya
kebutuhan teknik DNA rekombinan dlam penelitian tumbuhan, metode yang digunakan
dalam isolasi DNA menjadi perhatian utama. Metode yang biasa digunakan saat ini
merupakan metode yang membutuhkan biaya dan peralatan yang sangat mahal,
langkah pertama yang dilakukan dalam isolasi DNA adlah membuka jaringan dari
bahan yang akan diisolasi. Bahan yang digunakan harus cukup kuat dalam membuka
sel, karena adanya dinding sel, tetapi tidak sampai merusak isi sel, apalagi
sampai memotong DNA. Bahan yang digunakan sebaiknya dari bahan yang segar,
karena bahan yang sudah terlalu lama dan tidak segera diisolasi akan mengandung
DNA yang sudah Terdegradasi lama dan dpat juga terkontaminasi dengan DNA
eksogen, misalnya oleh DNA bakteri. (HOEZEL,1998)
Preparasi DNA yang panjang
dan murni merupakan suatu yang sangat diharapkan. Tekanan yang dibutuhkan untuk
membuka dinding sel juga dpat memotong DNA. Sehingga dipertlukan tindakan yang
harus sungguh-sungguh menjaga DNA yang dihasilkan dan panjangnya nucleus yang
utuh merupakan sumber yang baik untuk DNA tumbuhan yang panjang. Nucleus
tersebut bias sulit untuk diisolasi dlam jumlah yang banyak, dan teknik yang
dibutuhkan sangat sulit. Polisakarida dan tannin merupakan masalash utama dalam
tumbuhan karena sulit dipisahkan dengan DNA. (MURRAY AND THOMSON, 1980)
Secara umum prosedur
ekstraksi untuk isolasi DNA harus memenuhi tiga kriteria utama :
1.
Harus bias menghasilkan DNA yang murni untuk
penggunaan selanjutnya misalnya untuk analisis RLFP harus digunakan DNA yang
cukup murni untuk bias dipotong oleh rescriction, endonuclease dan ditransfer
ke membrane untuk analisis southem. Untuk analisis polymerase chain reaction
(PCR) esktak DNA harus tak mengandung kontaminan DNA yang dapat mengganggu PCR.
2.
DNA harus utuh untuk memberikan pola mograsi
yang akurat pada gel electrophoresis
3.
DAN yang dihasilkan harus mencukupi
4. Prosedur
yang digunakan harus cepar, sederhana dan murah, jika memungkinkan bias dihindari
penggunaan bahan kimia yang berbahaya. (CLARK, 1997)
Hasil isolasi DNA yang diperoleh dapat
dideteksi dengan metode lain dan DNA diperoleh dapat digunakan sebagai cetakan
untuk reaksi PCR. Konsentrasi detergen yang direkomendasikan adalah 100ml
deterjen cair ditambah dengan 1,5 aquades. Bubuk sabun cuci yang dijual
dipasaran biasanya mengandung campuran detergen (untuk menghilangkan
bahan-bahan organic), enzim (misalnya protease dan lipase) dan kompleks
periheleat (misalnya EDTA), seperti kandungan pada buffer yang biasanya
digunakan pada isolasi DNA.
Oleh sebab itu, sebaiknya pada metode dengan
menggunakan detergen komersial kita memasukkan bahan tanaman ke dalam detergen
pada saat bahan tersebut dihancurkan. Karena pada saat penghancuran sel-sel
lepas akan segera rusak membrannya Karen adanya detergen. Dan DNA seakan segera
dinonaktifkan. Selain waktunya lebih cepat, diharapkan dengan perlakuan seperti
itu akan dapat mengurangi tingkat kerusakan DNA. (SURYO, 2004)
Prinsip-prinsip dalammengisolasi DNA :
1.
Melisis sel secara fisik, dengan cara
penggerusan
2.
Pemecahan dinding sel
3.
Pemecahan membrane sel
4. Pemisahan
DNA dari bahan yang lain (KIRSMAN, 2010)
B.
ALAT DAN BAHAN
ALAT :
Gelas kimia 250 ml (2 buah)
Tabung reaksi (5 buah)
Erlenmeyer 250 ml (2 buah)
Coorng kaca (1 buah)
Lumping perselen (1 set)
Pipet tetes panjang (2 buah)
Batang pengaduk (1 buah)
Waterbatch (1 set)
Gelas ukur 10 ml (1 buah)
Penjepit tabung (1 buah)
Botol semprot (1 buah)
Kain kasa / kapas (secukupnya)
BAHAN :
Buah kiwi (boleh diganti)
Garam NaCl
Deterjen secukupnya
Etanol 95% (dingin/disimpan dalam freezer)
HNO3 pekat
Larutan ammonium molibdat 5%
Larutan asam asetat 5%
Larutan CuSO4 5%
Larutan NaHSO4 jenuh
Reagen Bennedict
Batu es
aquades
A.
CARA KERJA
a.
ekstraksi DNA dari buah
1.
Mengambil kulit buah dan potong
2.
Hancurkan dalam gelas kimia 250 ml
3.
Menambahkan 3 gram NaCl
4.
Mengaduk
5.
Menambahkan 10 ml detergen
6.
Menambahkan aquades hingga volume 100 ml
7.
Menghancurkan lagi
8.
Menyaring dengan kain kasa, filtrate dikumpulkan
9.
Mendiamkan filtrate
10. Memindahkan
11. Mengambil
6 ml sampel yang jernih
12. Memasukkan
dalam tabung reaksi
13. Mendinginkan
filtrate dalam es kira-kira 5 menit
14. Menambahkan
9 ml etanol 95% dingin
15. Menunggu,
ambil DNA
16. Jika
filtrate mengandung DNA lakukan uji komponen penyusun DNA untuk percobaan
berikutnya
b.
Pengujian ekstrak asam nukleat
a)
Ribose
1.
Mengambil 5 ml asam nukleat
2.
Menambahkan 4ml reagen benedict
3.
Kocok
4.
Memanaskan
5.
Mengamati
b)
Fosfat
1.
Mengambil 2 ml asam nukleat
2.
Menambahkan 1ml HNO3
3.
Memanaskan
4.
Menambahkan 2 ml larutan ammonium molibdat 5%
5.
Mengamati
c)
Basa nitrogen
1.
Mengambil 2 ml ekstrak asam nukleat
2.
Menambahkan beberapa tetes asam nukleat 5%
3.
Memanaskan
4.
Menambhakan 1 ml larutan CuSO4
5.
Menambahkan 1 ml larutan NaHSO3
6.
Menguji lilitan DNA terhadap komponen yang
dikandungnya.
DAFTAR PUSTAKA
Clark. 1997.
Genetika Edisi Keempat. Jakarta: Erlangga.
Hoezel. 1998.
Studi dan Eksperimen Gen. Jakarta: Sagung setu.
Kirsman.
2010. Isolasi DNA buah. Jakarta: Erlangga.
Murray dan Thomson.
1980. Biologi Molekuler Sel Edisi Kedua. Jakarta: Gramedia.
Suryo. 2004.
Genetika Strata 1. Yogyakarta: UGM.
Surzycki.
2000. Biologi jilid 1 edisi 3. Jakarta: Erlangga.
Tim Biokimia.
2017. Penuntun Praktikum Biokimia. Padang: UNP
Yuwono, T.
2008. Biologi Molekuler. Jakarta: Erlangga.
