EKSTRAKSI DNA DARI BUAH (BIOKIMIA)

EKSTRAKSI DNA DARI BUAH

A.     TUJUAN PRAKTIKUM

1.     Mahasiswa dapat mendiskusikan tentang DNA

2.     Mahasiswa dpaat membuat reagen yang terkait dengan percobaan di atas

3.     Mahasiswa dapat memakai alat dalam percobaan ini

4.     Mahasiswa dapat mengumpulkan data dan menganalisanya

5.     Mahasiswa dapat merumuskan kesimpulan

6.     Mahasiswa dapat mengkomunikasikan hasil percobaan

B.     DASAR TEORI

Asam nukleat adalaha suatu polinukleotida yang berfungsi sebagai pembawa, penyimpan dan pentransfer informasi genetika pada makhluk hidup. Monomer asam nukleat adalah nukleotida. Komponen penyusun nukleotida adalah basa nitrogen, monosakarida denagn lima atom C dan gugus fosfat. Asam nukleat ada dua yaitu DNA dan RNA. Untuk memperoleh DNA dapat dilakukan dengan mengekstraknya dari suatu bahan dengan menggunakan beberaoa reagen. Komponen DNA adalah basa nitrogen (adenine, timin, guanine, dan sitosin), Doeksiribosa (monosakarida dengan lima atom C), dan gugus fosfat. Sedangkan komponen RNA adalah basa nitrogen (Adenin, Urasil, Guanin, dan Sitosin), ribose,(monosakarida dengan lima atom C) dan gusus fosfat (TIM BIOKIMIA, 2017)

Ekstraksi DNA adalah langkah pertama yang sangat penting dalam langkah-langkah kerja analisis DNA sequencing. Kualitas secara keseluruhan, akurasi dan panjang pembacaan urutan basa DNA dapat dipengaruhi secara signifikan oleh karakter sampel itu sendiri dan metode yang dipakai untuk ekstraksi DNA. Mengisolasi DNA dengan kualitas tinggi dari berbagai jenis sampel memiliki tantangan tertsendiri, dan metode yang ideal akan beragam bergantung pada jenis jaringan, bagaimana dia diperoleh dari sumbernya, dan bagaimana sampel ditangani atau disimpan sebelum diesktrak. Metode untuk isolasi asam nukleat sering dikerjakan menggunakan penghancuran, mekanik atau metode kimiawi, yang kadang-kadang juga terotomatisasi. Baik metode ekstraksi manual maupun otomatis yang digunakan kita harus berhati-hatu untuk meminimalisir degradai DNA dengan menghindari ekspos terhadap panas, cahaya, Freese-thaw yang berulang-ulang dan vortex. Selanjutnya, laboratorium harus diatur sedemikian rupa untuk meminimalisir kemungkinan kontaminasi silang diantara sampel (YUWONO, 2008)

Asam nukleat adalah makromolekul yang berfungsi sebagau pembawa informasi genetika pada makhluk hidup. Monomer asam nukleat adalah nukleotida. Komponen penyususn nukleotida adalah basa nitrogen, monosakarida dengan lima atom C dan gugus fosfat. Untuk memperoleh DNA dapat dilakukan dengan mengekstraksnya dengan reagen tertentu.

Isolasi DNA juga merupakan langkah pertama dalam studi sekuen DNA dari pupolasi DNA kompleks dan dalam analisis struktur gen dan ekspresi gen. Kualitas  dan integritas akan mempengaruhi hasil yang diperoleh secara langsung (SUEZYCKI, 2000)

Dengan meningkatnya kebutuhan teknik DNA rekombinan dlam penelitian tumbuhan, metode yang digunakan dalam isolasi DNA menjadi perhatian utama. Metode yang biasa digunakan saat ini merupakan metode yang membutuhkan biaya dan peralatan yang sangat mahal, langkah pertama yang dilakukan dalam isolasi DNA adlah membuka jaringan dari bahan yang akan diisolasi. Bahan yang digunakan harus cukup kuat dalam membuka sel, karena adanya dinding sel, tetapi tidak sampai merusak isi sel, apalagi sampai memotong DNA. Bahan yang digunakan sebaiknya dari bahan yang segar, karena bahan yang sudah terlalu lama dan tidak segera diisolasi akan mengandung DNA yang sudah Terdegradasi lama dan dpat juga terkontaminasi dengan DNA eksogen, misalnya oleh DNA bakteri. (HOEZEL,1998)

Preparasi DNA yang panjang dan murni merupakan suatu yang sangat diharapkan. Tekanan yang dibutuhkan untuk membuka dinding sel juga dpat memotong DNA. Sehingga dipertlukan tindakan yang harus sungguh-sungguh menjaga DNA yang dihasilkan dan panjangnya nucleus yang utuh merupakan sumber yang baik untuk DNA tumbuhan yang panjang. Nucleus tersebut bias sulit untuk diisolasi dlam jumlah yang banyak, dan teknik yang dibutuhkan sangat sulit. Polisakarida dan tannin merupakan masalash utama dalam tumbuhan karena sulit dipisahkan dengan DNA. (MURRAY AND THOMSON, 1980)

Secara umum prosedur ekstraksi untuk isolasi DNA harus memenuhi tiga kriteria utama :

1.     Harus bias menghasilkan DNA yang murni untuk penggunaan selanjutnya misalnya untuk analisis RLFP harus digunakan DNA yang cukup murni untuk bias dipotong oleh rescriction, endonuclease dan ditransfer ke membrane untuk analisis southem. Untuk analisis polymerase chain reaction (PCR) esktak DNA harus tak mengandung kontaminan DNA yang dapat mengganggu PCR.

2.     DNA harus utuh untuk memberikan pola mograsi yang akurat pada gel electrophoresis

3.     DAN yang dihasilkan harus mencukupi

4.     Prosedur yang digunakan harus cepar, sederhana dan murah, jika memungkinkan bias dihindari penggunaan bahan kimia yang berbahaya. (CLARK, 1997)

Hasil isolasi DNA yang diperoleh dapat dideteksi dengan metode lain dan DNA diperoleh dapat digunakan sebagai cetakan untuk reaksi PCR. Konsentrasi detergen yang direkomendasikan adalah 100ml deterjen cair ditambah dengan 1,5 aquades. Bubuk sabun cuci yang dijual dipasaran biasanya mengandung campuran detergen (untuk menghilangkan bahan-bahan organic), enzim (misalnya protease dan lipase) dan kompleks periheleat (misalnya EDTA), seperti kandungan pada buffer yang biasanya digunakan pada isolasi DNA.

Oleh sebab itu, sebaiknya pada metode dengan menggunakan detergen komersial kita memasukkan bahan tanaman ke dalam detergen pada saat bahan tersebut dihancurkan. Karena pada saat penghancuran sel-sel lepas akan segera rusak membrannya Karen adanya detergen. Dan DNA seakan segera dinonaktifkan. Selain waktunya lebih cepat, diharapkan dengan perlakuan seperti itu akan dapat mengurangi tingkat kerusakan DNA. (SURYO, 2004)

Prinsip-prinsip dalammengisolasi DNA :

1.     Melisis sel secara fisik, dengan cara penggerusan

2.     Pemecahan dinding sel

3.     Pemecahan membrane sel

4.     Pemisahan DNA dari bahan yang lain (KIRSMAN, 2010)

B.     ALAT DAN BAHAN

ALAT :

Gelas kimia 250 ml (2 buah)

Tabung reaksi (5 buah)

Erlenmeyer 250 ml (2 buah)

Coorng kaca (1 buah)

Lumping perselen (1 set)

Pipet tetes panjang (2 buah)

Batang pengaduk (1 buah)

Waterbatch (1 set)

Gelas ukur 10 ml (1 buah)

Penjepit tabung (1 buah)

Botol semprot (1 buah)

Kain kasa / kapas (secukupnya)

BAHAN :

Buah kiwi (boleh diganti)

Garam NaCl

Deterjen secukupnya

Etanol 95% (dingin/disimpan dalam freezer)

HNO₃ pekat

Larutan ammonium molibdat 5%

Larutan asam asetat 5%

Larutan CuSO₄ 5%

Larutan NaHSO₄ jenuh

Reagen Bennedict

Batu es

aquades

A.     CARA KERJA

a.     ekstraksi DNA dari buah

1.     Mengambil kulit buah dan potong

2.     Hancurkan dalam gelas kimia 250 ml

3.     Menambahkan 3 gram NaCl

4.     Mengaduk

5.     Menambahkan 10 ml detergen

6.     Menambahkan aquades hingga volume 100 ml

7.     Menghancurkan lagi

8.     Menyaring dengan kain kasa, filtrate dikumpulkan

9.     Mendiamkan filtrate

10. Memindahkan

11. Mengambil 6 ml sampel yang jernih

12. Memasukkan dalam tabung reaksi

13. Mendinginkan filtrate dalam es kira-kira 5 menit

14. Menambahkan 9 ml etanol 95% dingin

15. Menunggu, ambil DNA

16. Jika filtrate mengandung DNA lakukan uji komponen penyusun DNA untuk percobaan berikutnya

b.     Pengujian ekstrak asam nukleat

a)    Ribose

1.     Mengambil 5 ml asam nukleat

2.     Menambahkan 4ml reagen benedict

3.     Kocok

4.     Memanaskan

5.     Mengamati

b)   Fosfat

1.     Mengambil 2 ml asam nukleat

2.     Menambahkan 1ml HNO₃

3.     Memanaskan

4.     Menambahkan 2 ml larutan ammonium molibdat 5%

5.     Mengamati

c)    Basa nitrogen

1.     Mengambil 2 ml ekstrak asam nukleat

2.     Menambahkan beberapa tetes asam nukleat 5%

3.     Memanaskan

4.     Menambhakan 1 ml larutan CuSO₄

5.     Menambahkan 1 ml larutan NaHSO₃

6.     Menguji lilitan DNA terhadap komponen yang dikandungnya.

DAFTAR PUSTAKA

Clark. 1997. Genetika Edisi Keempat. Jakarta: Erlangga.

Hoezel. 1998. Studi dan Eksperimen Gen. Jakarta: Sagung setu.

Kirsman. 2010. Isolasi DNA buah. Jakarta: Erlangga.

Murray dan Thomson. 1980. Biologi Molekuler Sel Edisi Kedua. Jakarta: Gramedia.

Suryo. 2004. Genetika Strata 1. Yogyakarta: UGM.

Surzycki. 2000. Biologi jilid 1 edisi 3. Jakarta: Erlangga.

Tim Biokimia. 2017. Penuntun Praktikum Biokimia. Padang: UNP

Yuwono, T. 2008. Biologi Molekuler. Jakarta: Erlangga.